Исследование появилось в сети Интернет в Nature Biotechnology 3 апреля 2017 г.
«Выявление единичных мутаций, вызывающих редкие разрушительные заболевания, такие как мышечная дистрофия, стало относительно простым», — сказал Чарльз Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Дьюка. "Но более распространенные болезни, которые передаются в семье, часто связаны с множеством генов, а также генетическими реакциями на факторы окружающей среды. Это гораздо более сложная история, и мы хотели найти способ лучше ее понять.
Теперь мы нашли способ."
Новый метод основан на системе взлома генов под названием CRISPR / Cas9. Первоначально обнаруженная как естественный противовирусный защитный механизм у бактерий, система распознает и размещает генетический код предыдущих злоумышленников, а затем расщепляет их ДНК. В последние несколько лет исследователи использовали эту биологическую систему для точного вырезания и вставки последовательностей ДНК в живых организмах.
В текущем исследовании исследователи добавили молекулярный механизм, который может контролировать активность генов, манипулируя сетью биомолекул, которая определяет, какие гены активирует каждая клетка и в какой степени.
С помощью нового инструмента Герсбах и его коллеги исследуют 98 процентов нашего генетического кода, которые часто называют «темной материей генома»."
«Лишь небольшая часть нашего генома кодирует инструкции по производству белков, которые направляют клеточную активность», — сказал Тайлер Кланн, аспирант биомедицинской инженерии, руководивший работой в лаборатории Герсбаха. "Но более 90 процентов генетической изменчивости в человеческой популяции, связанной с распространенными заболеваниями, выходит за рамки этих генов.
Мы решили разработать технологию, чтобы отобразить эту часть генома и понять, что она делает."
По словам Кланна, ответ заключается в промоторах и энхансерах.
Промоутеры располагаются непосредственно рядом с контролируемыми ими генами. Однако энхансеры, которые модулируют промоторы, могут быть где угодно из-за сложной трехмерной геометрии генома, что затрудняет понимание того, что они на самом деле делают.
«Если энхансер увеличивает или уменьшает промотор на 10 или 20 процентов, это может логически объяснить небольшой генетический вклад, например, в сердечно-сосудистые заболевания», — сказал Герсбах. «С помощью этой системы на основе CRISPR мы можем более сильно включать и выключать эти усилители, чтобы точно увидеть, какой эффект они оказывают на клетку. Разрабатывая методы лечения, которые более резко влияют на эти цели в правильном направлении, мы могли бы значительно повлиять на соответствующее заболевание."
Все это хорошо и хорошо для изучения областей генома, которые исследователи уже определили как связанные с заболеваниями, но потенциально в геноме есть миллионы участков с неизвестными функциями. Чтобы погрузиться в темную кроличью нору генома, Герсбах обратился к своим коллегам Грегу Кроуфорду, доценту педиатрии и медицинской генетики, и Тиму Редди, доценту кафедры биоинформатики и биостатистики. Все три профессора работают вместе в Центре геномной и компьютерной биологии Duke.
Кроуфорд разработал способ определения того, какие участки ДНК открыты для бизнеса. То есть, какие разделы не упакованы плотно, что обеспечивает доступ для взаимодействия с биомашинами, такими как РНК и белки.
Исследователи считают, что эти сайты, скорее всего, каким-то образом способствуют активности клетки. Редди разрабатывает вычислительные инструменты для интерпретации этих больших наборов геномных данных.
За последнее десятилетие Кроуфорд просканировал сотни типов клеток и тканей, пораженных различными заболеваниями и лекарствами, и составил список из более чем 2 миллионов потенциально важных участков в темном геноме — явно слишком много, чтобы исследовать одно целое. время.
В новом исследовании Кроуфорд, Редди и Герсбах демонстрируют высокопроизводительный метод скрининга для исследования многих из этих потенциально важных генетических последовательностей в короткие сроки. В то время как эти первоначальные исследования проверяли сотни этих сайтов на миллионах пар оснований генома, теперь исследователи работают над увеличением этого показателя в 100–1000 раз.
«Маленькие молекулы могут быть нацелены на белки, а РНК-интерференция нацелена на РНК, но нам нужно было что-то, что могло бы модулировать некодирующую часть генома», — сказал Кроуфорд. "До сих пор у нас не было этого."
Метод начинается с доставки миллионов систем CRISPR, загруженных в вирусы, каждая из которых нацелена на разные генетические точки интереса, к миллионам клеток в одной чашке.
Убедившись, что каждая клетка получает только один вирус, команда проверяет их на изменения в экспрессии генов или клеточных функциях.
Например, кто-то, изучающий диабет, может делать это с клетками поджелудочной железы и наблюдать за изменениями в производстве инсулина. Те клетки, которые показывают интересные изменения, затем выделяются и секвенируются, чтобы определить, какой участок ДНК затронул CRISPR, что открывает новый генетический фрагмент головоломки диабета.
Этот метод уже дает результаты, выявляя ранее известные генетические регуляторные элементы, а также выявляя несколько новых.
Результаты также показали, что его можно использовать для включения или выключения генов, что превосходит другие инструменты для изучения биологии, которые только выключают гены. Различные типы клеток также давали разные — но частично совпадающие — результаты, подчеркивая биологическую сложность регуляции генов и болезней, которые можно исследовать с помощью этой технологии.
«Теперь, когда у нас есть этот инструмент, мы можем войти и аннотировать функции этих ранее неизвестных, но важных участков нашего генома», — сказал Герсбах. «Имея так много мест, где можно поискать, и имея возможность делать это быстро и надежно, мы, несомненно, найдем новые сегменты, важные для лечения болезней, которые откроют новые возможности для разработки терапевтических средств."