Расшифровка генетической файловой системы клетки

Доступ к этим тщательно упакованным генам регулируется посттрансляционными модификациями, химическими изменениями структуры гистонов, которые действуют как сигналы включения-выключения для транскрипции генов. Ошибки или мутации в гистонах могут вызывать такие заболевания, как глиобластома, разрушительный рак мозга у детей.
Исследователи из Принстонского университета разработали простой метод введения в клетки ненативного хроматина для исследования этих сигнальных путей. Эта работа, опубликованная 6 апреля в журнале Nature Chemistry, является последним химическим вкладом лаборатории Мюира в понимание замечательной системы индексации информации в природе.

Том Мьюир, Ван Зандт Уильямс, младший. Класс 65-го года, профессор химии, начал исследование транскрипционных путей в так называемой области эпигенетики почти десятью годами ранее.

Расшифровка такой сложной и динамичной системы представляла собой серьезную задачу, но его исследовательская лаборатория не остановилась. «Лучше потерпеть неудачу в чем-то важном, чем добиться успеха в чем-то тривиальном», — сказал он.
Мьюир признал ценность введения химических подходов в эпигенетику в дополнение к ранним вкладам молекулярных биологов и генетиков. По его словам, если эпигенетика была похожа на пьесу, молекулярная биология и генетика могли бы идентифицировать персонажей, но для понимания сюжетов нужна химия.
Эти подзаголовки или посттрансляционные модификации гистонов, которых насчитывается более 100, могут происходить совместно и одновременно.

Традиционные методы исследования посттрансляционных модификаций включают синтез модифицированных гистонов по одному, что является очень медленным процессом, требующим большого количества биологического материала.

В прошлом году группа Muir представила метод, который значительно ускорил бы этот процесс. Исследователи создали библиотеку из 54 нуклеосом — единичных единиц хроматина, подобных жемчужинам на ожерелье, — закодированных с помощью штрих-кодов ДНК, уникальных генетических тегов, которые можно легко идентифицировать. Опубликованный в журнале Nature Methods, высокопроизводительный метод требовал только микрограмм каждой нуклеосомы для выполнения примерно 4500 биохимических анализов.

"Скорость и чувствительность анализа были шокирующими", — сказал Мьюир. Каждый биохимический анализ включал обработку нуклеосомы со штрих-кодом ДНК записывающим устройством, считывающим устройством или ядерным экстрактом, чтобы выявить конкретное предпочтение связывания гистона. Затем продукты были выделены с использованием метода, называемого иммунопреципитацией хроматина, и охарактеризованы секвенированием ДНК, по сути, упорядоченным считыванием нуклеотидов.

«За последние 10 лет были достигнуты невероятные успехи в области генетического секвенирования, которые сделали эту работу возможной», — сказал Мануэль Мюллер, научный сотрудник лаборатории Мюира и соавтор статьи в Nature Methods.
С помощью этого метода исследователи могли систематически опрашивать сигнальную систему, чтобы предлагать механистические пути.

Но эти механистические идеи останутся гипотезами, если они не будут подтверждены in vivo, то есть внутри клеточной среды.
«Единственный метод модификации гистонов in vivo был чрезвычайно сложным и специфическим», — сказала Яэль Дэвид, научный сотрудник лаборатории Мюира и ведущий автор недавнего исследования Nature Chemistry, которое продемонстрировало новый и легко настраиваемый подход.
Метод основан на использовании сверхбыстрых расщепляемых интеинов, белковых фрагментов, которые имеют большое сродство друг к другу. Сначала один фрагмент интеина был присоединен к модифицированному гистону путем кодирования его в клетку.

Затем другой фрагмент интеина был синтетически слит с меткой, которая могла быть небольшой белковой меткой, флуорофором или даже целым белком, таким как убиквитин.
В течение нескольких минут после введения в клетку меченый фрагмент интеина связывается с фрагментом интеина гистона.

Затем, подобно эффективным и вежливым сватам, интеины вырезали себя и создали новую связь между меткой и модифицированным гистоном. "Это действительно прекрасный способ создания белков в клетке", — сказал Дэвид.
Области гистона могут быть неплотно или плотно упакованы, в зависимости от сигналов от клетки, указывающих, следует ли транскрибировать ген.

Постепенно снижая количество введенного меченого интеина, исследователи могли узнать о структуре хроматина и определить, какие области были более доступны, чем другие.
В планах на будущее в лаборатории Мюира эти методы будут использоваться для постановки конкретных биологических вопросов, например, можно ли изменить исход болезни, манипулируя сигнальным путем. «В конечном итоге мы разрабатываем методы для решения биологических вопросов», — сказал Мьюир.

Портал обо всем