«Мы наблюдаем за одной клеткой за раз» и используем цифровую камеру и специальный микроскоп, чтобы снимать фильмы и снимать процесс роста бутонов, — говорит вирусолог Савез Саффариан, доцент физики и астрономии и старший автор опубликованного нового исследования зарождения ВИЧ. онлайн сегодня в журнале Public Library of Science PLOS ONE.
«Мы впервые увидели, как ALIX была задействована в борьбе с ВИЧ», — говорит он. "Все знали, что ALIX участвует в зарождении ВИЧ, но никто не мог представить себе привлечение ALIX в этот процесс."
По словам Саффариана, открытие является «фундаментальной фундаментальной наукой» и не имеет непосредственного клинического значения для пациентов со СПИДом, потому что ALIX участвует в слишком многих критических функциях, таких как деление клеток, чтобы стать вероятной мишенью для новых лекарств.
«Мы много знаем о белках, которые помогают ВИЧ выйти из клетки, но мы не знаем, как они объединяются, чтобы помочь вирусу выбраться, и в ближайшие 10-20 лет мы узнаем многое. подробнее об этом механизме ", — добавляет он. "Будет ли это мишенью для наркотиков? Будет ли это частью биохимии, используемой в терапевтической или биотехнологической промышленности позже?? Я не могу тебе сказать сейчас. Но если бы это было не из-за нашего биологического любопытства, у нас не было бы технологий, которые есть сегодня."
Новое исследование «отличная работа», — говорит эксперт по ВИЧ-инфекции Уэс Сандквист, который консультировал Саффариана и является профессором и сопредседателем кафедры биохимии в Медицинской школе Университета Юты. "Это представляет неподдельный интерес для тех из нас, кто изучает механизм сборки ВИЧ."
Исследование финансировалось Национальным научным фондом.
Саффариан проводил исследование с первым автором, Пей-И Ку, докторантом физики Университета штата Юта; Мурад Бендженнат, докторант физики и астрономии; техник Джефф Баллью; и Майкл Ландесман, еще один доктор физики и астрономии, ранее работавший в биохимической лаборатории Сандквиста.
Смотрите, не трогайте, как HIV Buds
Биохимические методы, используемые в течение многих лет, включают сбор миллионов вирусов в лабораторной посуде и выполнение различных анализов для выявления белков, из которых состоит вирус — например, с использованием антител, которые связываются с определенными белками, и использования других белков, которые заставляют первые белки флуоресцировать таким образом. их можно увидеть.
"Вы не делаете это по одному вирусу за раз", — говорит Саффариан. "Проблема в том, что вы не видите различий между похожими вирусами. И вы не видите времени, в течение которого различные белки приходят и уходят, чтобы помочь вирусу выйти из клетки."
Другие методы замораживают или иным образом фиксируют клетки по мере того, как из них выходят новые частицы ВИЧ, и используют электронный микроскоп для фотографирования этих изображений репликации вируса в режиме стоп-кадра.
Saffarian также использует технологию, известную как «флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения», которая использовалась для изучения динамических процессов в клетках.
Этот метод использовался ранее для получения изображений зарождения ВИЧ и аналогичного лошадиного вируса EIAV. Но Саффариан говорит, что исследование не показало, что ALIX участвует в размножении ВИЧ, и в нем были недостатки, которые ошибочно указывали на то, что белок ALIX был задействован довольно рано в процессе размножения EIAV, предполагая, что он сделал то же самое при размножении ВИЧ.
Ку, Саффариан и его коллеги объединили этот метод микроскопии с улучшенным способом генетического связывания зеленой флуоресцентной «метки» с белками ALIX в клонированных клетках, чтобы они могли видеть белки без ущерба для их нормальной функции. Исследователи перепробовали множество так называемых «линкеров» и нашли тот, который позволяет им видеть белки ALIX, когда они участвуют в почковании ВИЧ, но без нарушения этого процесса.
Ни технология микроскопа, ни маркировка белков зеленой флуоресценцией не новы, но «то, что мы сделали новшеством, это то, что мы связали эти флуоресцентные белки с ALIX, используя множество различных видов линкеров», чтобы найти тот, который позволяет белку ALIX функционировать должным образом, — добавляет он.
По словам Саффариана, проблема более ранних исследований — которые показали, что ALIX участвует в процессе образования почки — заключалась в том, что использовался только один линкер, и это нарушало нормальную функцию ALIX.
Взгляд на белки, образующие ВИЧ
Когда ВИЧ реплицируется внутри клетки человека, белок под названием Gag составляет большую часть новых частиц — в одной частице ВИЧ содержится 4000 копий белка Gag — хотя в процесс участвует множество других белков, включая ALIX, что означает «взаимодействующий с alg-2 белок x.«Эксперименты, подобные тем, что проводятся командой Саффариана, используют« вирусоподобные частицы », которые представляют собой частицы ВИЧ, у которых отсутствует их генетический план или геном, поэтому они не представляют риска заражения в лаборатории.
«Вирусоподобные частицы сохраняют ту же геометрию и тот же процесс размножения, что и инфекционный ВИЧ», — говорит Саффариан.
Во время почкования белки Gag собираются на внутренней стороне клеточной мембраны — вместе с ALIX на поздних стадиях — и образуют новую частицу ВИЧ, которая выталкивает свой путь из клетки — процесс, посредством которого СПИД распространяется среди инфицированного человека. от камеры к камере.
Чтобы посмотреть на процесс бутонизации, Ку, Саффариан и его коллеги поместили клетки HELA человека, содержащие частицы, в небольшом количестве жидкой питательной среды в чашку Петри и поместили ее под микроскоп, который находится в стеклянной камере, поддерживаемой при температуре тела, чтобы клетки могут оставаться живыми более 48 часов. Твердотельный синий лазер нацелен на образец, чтобы заставить белки ALIX с зеленой меткой и Gag с красной меткой светиться или флуоресцировать, чтобы их можно было увидеть, когда они собираются в частицу вируса.
С белками Gag, помеченными красным цветом, и белками ALIX, помеченными зеленым, «мы могли видеть, что ALIX приходит в конце сборки вирусной частицы», при этом около 100 белков ALIX сходятся с примерно 4000 молекулами Gag и собираются в новую частицу ВИЧ. Затем ALIX вводит два других белка, которые отрезают зарождающуюся вирусную частицу от клетки, когда она появляется. Положение ALIX во время отщипывания новых частиц раньше не распознавалось, говорит Саффариан
Исследователи наблюдали, как вирусные частицы распускаются из одной клетки за раз: обычно около 100 из них появлялись в течение двухчасового периода.
Саффариан говорит, что большая часть белков ALIX ушла, когда сборка ВИЧ была завершена, и вернулась в жидкость внутри клетки.
Он говорит, что открытие, что ALIX не участвует до тех пор, пока не начнутся поздние стадии размножения ВИЧ, предполагает существование ранее неизвестного механизма в вирусе, который регулирует время ALIX и других белков в сборке новых частиц ВИЧ.
«Мы обнаружили, что клеточные компоненты, которые способствуют высвобождению вируса, на самом деле прибывают по гораздо более сложной временной схеме, чем прогнозировалось на основе биохимических данных», — говорит Саффариан. «Результат этого исследования является многообещающим, поскольку он раскрывает новый регуляторный механизм рекрутирования клеточных компонентов в сайты образования зародышей ВИЧ и открывает двери для интересных будущих исследований механизма образования зародышей ВИЧ."