Работа — сотрудничество между Вивианой Градинару (BS ’05), доцентом кафедры биологии и биологической инженерии, и Фрэнсис Арнольд, профессором химической инженерии, биоинженерии и биохимии Дика и Барбары Дикинсон, — была описана в двух отдельных статьях, опубликованных здесь. месяц.Когда нейрон находится в состоянии покоя, каналы и насосы в клеточной мембране поддерживают клеточно-специфический баланс положительно и отрицательно заряженных ионов внутри и вне клетки, что приводит к постоянному мембранному напряжению, называемому потенциалом покоя клетки.
Однако при обнаружении стимула — например, запаха или звука — ионы проникают через вновь открытые каналы, вызывая изменение мембранного напряжения. Это изменение напряжения часто проявляется как потенциал действия — нейрональный импульс, который приводит в движение активность цепи.Инструмент, разработанный Градинару и Арнольдом, обнаруживает и служит маркером этих изменений напряжения.«Нашей главной целью для этого инструмента было достижение восприятия нейронной активности с помощью света, а не традиционной электрофизиологии, но для этой цели было несколько предпосылок», — говорит Градинару. «Датчик должен быть быстрым, поскольку потенциалы действия возникают всего за миллисекунды.
Кроме того, датчик должен быть очень ярким, чтобы сигнал мог быть обнаружен с помощью существующих установок микроскопии. И вы должны иметь возможность одновременно изучать несколько нейронов, которые составляют нейронную сеть ".
Исследователи начали с оптимизации Archaerhodopsin (Arch), светочувствительного белка бактерий. В природе опсины, такие как Арч, обнаруживают солнечный свет и инициируют движение микробов к свету, чтобы они могли начать фотосинтез. Однако исследователи могут также использовать светочувствительные свойства опсинов для нейробиологического метода, называемого оптогенетикой, при котором нейроны организма генетически модифицируются для экспрессии этих микробных опсинов.
Затем, просто посветив светом на модифицированные нейроны, исследователи могут контролировать активность клеток, а также их поведение в организме.Градинару ранее разработал Arch для лучшей переносимости и производительности в клетках млекопитающих в качестве традиционного оптогенетического инструмента, используемого для управления поведением организма с помощью света.
Когда модифицированные нейроны подвергаются воздействию зеленого света, Arch действует как ингибитор, контролируя активность нейронов — и, следовательно, связанное с ними поведение — путем предотвращения активации нейронов.Однако Градинару и Арнольд больше всего интересовало другое свойство Arch: при воздействии красного света белок действует как датчик напряжения, реагируя на изменения мембранного напряжения, создавая вспышку света в присутствии потенциала действия. Хотя это свойство в принципе могло позволить Arch обнаруживать активность нейронных сетей, световой сигнал, отмечающий эту нейронную активность, часто был слишком тусклым, чтобы его можно было увидеть.Чтобы решить эту проблему, Арнольд и ее коллеги сделали белок Arch более ярким, используя метод, называемый направленной эволюцией — технику, которую Арнольд впервые применил в начале 1990-х годов.
Исследователи ввели мутации в ген Arch, таким образом кодируя миллионы вариантов белка. Они перенесли мутированные гены в клетки E. coli, которые продуцировали мутантные белки, кодируемые этими генами. Затем они проверили тысячи полученных колоний E. coli на предмет интенсивности их флуоресценции.
Гены наиболее ярких версий были выделены и подвергнуты дальнейшим раундам мутагенеза и скрининга до тех пор, пока бактерии не вырабатывали белки, которые были в 20 раз ярче, чем исходный белок Arch.Статья с описанием процесса и созданных ярких новых вариантов белка была опубликована в выпуске журнала Proceedings of the National Academy of Science от 9 сентября.
«Этот эксперимент демонстрирует, как быстро эти замечательные бактериальные белки могут развиваться в ответ на новые потребности. Но еще более захватывающим является то, что они могут делать в нейронах, как обнаружила Вивиана», — говорит Арнольд.В отдельном исследовании, проведенном аспирантами Градинару Николасом Флитцанисом и Клэр Бедбрук, которую также консультирует Арнольд, исследователи генетически внедрили новые, более яркие варианты Arch в нейроны грызунов в культуре, чтобы увидеть, какая из этих версий наиболее чувствительна к изменениям напряжения. — и поэтому будет лучше всего при обнаружении потенциалов действия.
Один из вариантов, Archer1, был не только достаточно ярким и чувствительным, чтобы отмечать потенциалы действия в нейронах млекопитающих в реальном времени, но также мог использоваться для определения того, какие нейроны были синаптически связаны — и взаимодействовали друг с другом — в цепи.Работа описана в исследовании, опубликованном 15 сентября в журнале Nature Communications.
«Что было интересно, так это то, что мы бы увидели, как загорятся две клетки здесь, но не эта, потому что первые две синаптически связаны», — говорит Градинару. «Этот инструмент дал нам возможность наблюдать сеть, в которой возмущение одной ячейки влияет на другую».Однако самой большой проблемой оставалось восприятие активности живого организма и сопоставление этой активности с поведением. Для достижения этой цели команда Градинару работала с Полом Стернбергом, профессором биологии Томаса Ханта Моргана, чтобы протестировать Archer1 в качестве сенсора в живом организме — крошечном черве-нематоде C. elegans. «Есть несколько причин, по которым мы использовали червей здесь: это мощные организмы для быстрой генной инженерии, а их ткани почти прозрачны, что позволяет легко увидеть флуоресцентный белок в живом животном», — говорит она.
После включения Archer1 в нейроны, которые были частью обонятельной системы червя — основного источника сенсорной информации для C. elegans — исследователи подвергли червя воздействию запаха. Когда одорант присутствовал, наблюдался базовый флуоресцентный сигнал, а когда одорант был удален, исследователи могли видеть, как загорается цепь нейронов, что означает, что эти конкретные нейроны подавляются в присутствии стимула и активны в отсутствие стимула. стимул.
Эксперимент был первым случаем, когда вариант Arch был использован для наблюдения за активной цепью в живом организме.Затем Градинару надеется использовать такие инструменты, как Archer1, чтобы лучше понять сложные нейронные сети млекопитающих, используя микробные опсины в качестве сенсорных и исполнительных инструментов у оптогенетически модифицированных грызунов.
«Для будущей работы полезно, чтобы этот инструмент был бифункциональным. Хотя Archer1 действует как датчик напряжения при красном свете, при зеленом — это ингибитор», — говорит она. «Итак, теперь долгосрочная цель наших оптогенетических экспериментов — объединить инструменты со свойствами управления поведением и инструменты со свойствами измерения напряжения. Это позволило бы нам получить полностью оптический доступ к нейронным цепям.
Но я думаю, что есть впереди еще много работы ".По словам Градинару, одна из целей на будущее — сделать Archer1 еще ярче. Хотя флуоресценцию белка можно увидеть сквозь почти прозрачные ткани нематодного червя, непрозрачные органы, такие как мозг млекопитающих, по-прежнему представляют собой проблему. По ее словам, необходимо провести дополнительную работу, прежде чем Archer1 можно будет использовать для обнаружения изменений напряжения в нейронах живых, ведущих себя млекопитающих.
А для этого потребуется дальнейшее сотрудничество с белковыми инженерами и биохимиками, такими как Арнольд.«Как нейробиологи мы часто сталкиваемся с экспериментальными препятствиями, открывающими потенциал для новых методов.
Затем мы сотрудничаем для создания инструментов с помощью химии или инструментов, затем мы проверяем их и предлагаем оптимизации, и это продолжается», — говорит она. «Есть несколько вещей, которые мы хотели бы улучшить, и благодаря этим многочисленным итерациям и упорной работе это может произойти».Работа, опубликованная в обеих статьях, была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH), включая премию NIH / Национального института неврологических расстройств и нового новатора в области инсульта Градинару; Финансирование Институтом Бекмана центра BIONIC; гранты от Исследовательского управления армии США, а также грант на обучение в отделе биологии Калифорнийского технологического института и фонды для стартапов от президента и проректора Калифорнийского технологического института, а также Отдела биологии и биологической инженерии; и другая финансовая поддержка со стороны Фонда Шурла и Кея Курчи и Фонда исследований в области естественных наук.