CRISPR лечит генетическое заболевание у взрослых млекопитающих: система редактирования генов на мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна

Исследователи из Университета Дьюка ранее использовали CRISPR для исправления генетических мутаций в культивируемых клетках пациентов Дюшенна, а другие лаборатории исправляли гены одноклеточных эмбрионов в лабораторных условиях. Но последний подход в настоящее время неэтичен для людей, и первый сталкивается со многими препятствиями при доставке обработанных клеток обратно в мышечные ткани.
Другой подход, который включает доставку CRISPR непосредственно к пораженным тканям с помощью методов генной терапии, также сталкивается с проблемами, особенно с доставкой.

В новом исследовании исследователи из Университета Дьюка преодолели несколько из этих препятствий, используя непатогенный носитель, называемый аденоассоциированным вирусом, или AAV, для доставки системы редактирования генов.
Газета появится в декабре.

31, 2015 в науке.
«Недавняя дискуссия об использовании CRISPR для исправления генетических мутаций в человеческих эмбрионах по праву вызвала серьезную озабоченность в отношении этических последствий такого подхода», — сказал Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Дьюка. "Но использование CRISPR для исправления генетических мутаций в пораженных тканях больных пациентов не обсуждается. Эти исследования показывают путь, где это возможно, но еще предстоит проделать значительный объем работы."

Мышечная дистрофия Дюшенна вызвана проблемами со способностью организма вырабатывать дистрофин, длинную белковую цепь, которая связывает внутреннюю часть мышечного волокна с окружающей его опорной структурой. Дистрофин кодируется геном, содержащим 79 областей, кодирующих белок, называемых экзонами. Если в каком-либо экзоне происходит изнурительная мутация, цепь не строится.

Без поддержки дистрофина мышцы имеют тенденцию к измельчению и медленно разрушаются.
Дюшенн поражает одного из 5000 новорожденных мальчиков. Большинство пациентов прикованы к инвалидной коляске к 10 годам и не доживают до 20-30 лет. Мутация находится в Х-хромосоме, поэтому у девочек с двумя Х-хромосомами должна быть хотя бы одна функционирующая копия гена.

Герсбах работал над потенциальным генетическим лечением Дюшенна с помощью различных систем, изменяющих гены, с момента открытия своей лаборатории в Дьюке в 2009 году. Его лаборатория недавно начала фокусироваться на CRISPR / Cas9 — модифицированной версии бактериальной защитной системы, которая нацелена и разделяет ДНК знакомых вторгающихся вирусов.

В то время как Герсбах добился успеха в культивировании клеток пациентов, используя разряд электричества, чтобы пробить дыры в их мембранах для доставки системы CRISPR, эта стратегия не была практичной в мышечных тканях пациента.
"Основным препятствием для редактирования генов является доставка.

Мы знаем, какие гены необходимо исправить при определенных заболеваниях, но получить инструменты для редактирования генов там, где они должны быть, является огромной проблемой », — сказал Крис Нельсон, сотрудник лаборатории Герсбаха, руководивший работой. "Лучший способ сделать это прямо сейчас — воспользоваться преимуществами вирусов, потому что они потратили миллиарды лет на развитие, чтобы выяснить, как внедрить свои собственные вирусные гены в клетки."
Нельсон и Герсбах начали работать над упаковкой инструментов редактирования генов в AAV — самый популярный вирус для доставки генов на сегодняшний день. Им оказали помощь в сотрудничестве с экспертами AAV Аравиндом Асоканом, адъюнкт-профессором Медицинской школы Чапел-Хилл Университета Северной Каролины, и Донгшенгом Дуаном из Медицинской школы Университета Миссури.

Дуань также предоставил значительный опыт из долгой истории работы в области генной терапии нервно-мышечных расстройств.

Чтобы использовать вирусы в качестве средств доставки для генной терапии, исследователи извлекают из вируса все вредные и репликативные гены и вводят терапевтические гены, которые они хотят доставить.

В то время как ранние типы вирусов не работали хорошо по разным причинам, таким как интеграция в геном и вызывание проблем или запуск иммунных ответов, AAV до сих пор доказал свою особенность. Это непатогенный вирус, которому многие люди все равно подвергаются.
AAV используется во многих клинических испытаниях на поздних стадиях в США и уже одобрен для использования в одном препарате для генной терапии в Европейском Союзе. Существуют также разные версии AAV, которые могут преимущественно попадать в разные ткани, такие как скелетные и сердечные мышцы, поэтому исследователи могут доставлять их системно.

Но всегда есть подвох, и для Герсбаха это был вопрос размера.
«AAV — действительно маленький вирус, а CRISPR — относительно большой», — сказал Герсбах. "Он просто не подходит, поэтому у нас все еще была проблема с упаковкой."
Решение пришло от Фэн Чжана, исследователя из Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда. Ранее в этом году Чжан описал систему CRISPR от бактерии, отличной от обычно используемой.

В естественной бактериальной иммунной системе CRISPR — это снимок кружки, который помогает идентифицировать целевую ДНК, а Cas9 — это лезвие, которое разрезает нити. Большой белок Cas9, обычно используемый исследователями, происходит от бактериального вида Streptococcus pyogenes. Изучив бактериальное царство, Чжан обнаружил гораздо меньший белок Cas9 золотистого стафилококка.
Достаточно мал, чтобы удобно разместиться внутри AAV.

В ходе исследования исследователи работали с моделью мышей, у которой есть изнурительная мутация на одном из экзонов гена дистрофина. Они запрограммировали новую систему CRISPR / Cas9, чтобы вырезать дисфункциональный экзон, оставив естественную систему восстановления организма, чтобы сшить оставшийся ген обратно вместе, чтобы создать укороченную, но функциональную версию гена.
Помимо того, что это намного проще и эффективнее, чем замена дисфункционального экзона рабочей копией, простое удаление слабого звена является стратегией, которая будет эффективной в большей части популяции пациентов.
Герсбах и его команда сначала провели терапию непосредственно в мышце ноги взрослой мыши, что привело к восстановлению функционального дистрофина и увеличению мышечной силы.

Затем они ввели комбинацию CRISPR / AAV в кровоток мыши, чтобы достичь каждой мышцы. Результаты показали некоторую коррекцию мышц всего тела, в том числе сердца, — большая победа, потому что сердечная недостаточность часто является причиной смерти пациентов с Дюшеном.

«Еще предстоит проделать значительную работу, чтобы воплотить это в практике лечения людей и продемонстрировать безопасность», — сказал Герсбах. "Но эти результаты наших первых экспериментов очень впечатляют. Отсюда мы будем оптимизировать систему доставки, оценивать подход на более тяжелых моделях МДД и оценивать эффективность и безопасность на более крупных животных с конечной целью попасть в клинические испытания."

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *