В моделях мышей NRP2a ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, тогда как NRP2b способствует метастазированию и прогрессированию. Это новое понимание может привести к улучшенным методам лечения, которые специфически нацелены на NRP2b, сохраняя при этом ингибирующие опухоль функции NRP2a.Рак легких является высокоинвазивным, метастатическим и лекарственно-устойчивым заболеванием — на его долю ежегодно приходится пятая часть смертей от рака во всем мире. Частично злокачественные свойства рака легких обусловлены эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT), который в первую очередь индуцируется трансформирующим фактором роста бета (TGF-бета) и приводит к пролиферации раковых стволовых клеток.
Известно, что два человеческих NRP — NRP1 и NRP2 — часто активируются в опухолях и связаны с плохим прогнозом для пациентов. Предыдущая работа исследователей онкологического центра MUSC Hollings Роберта Геммилла, доктора философии. и Гарри Драбкин, доктор медицины, первый и старший авторы статьи в Science Signaling, продемонстрировали, что NRP2, в частности, активируется в культивируемых линиях NSCLC во время TGF-бета-опосредованной EMT.
Кроме того, было обнаружено, что ингибирование NRP2 снижает опосредованные TGF-бета ответы, включая инвазивный рост опухоли.Однако на сегодняшний день почти все исследования NRP2 сосредоточены на изоформе 2a. До сих пор NRP2b, изоформа с альтернативным сплайсингом, была в значительной степени не исследована и плохо изучена.
«Большинство исследований было сосредоточено на понимании основных эффектов NRP2 в целом и на самом деле не касалось разделения ролей его составных частей — изоформ 2a и 2b», — объяснил Геммилл, который возглавляет кафедру по борьбе с раком Мелвина Берлински. Исследования в MUSC. «Итак, мы знаем, что NRP2a и NRP2b почти идентичны — только последние 100 аминокислот на С-конце различаются. Были некоторые предположения, что они могут иметь разные функции, но большинство из нас предполагало, что эти различия незначительны».«Оказывается, существует множество вариантов молекул, на которые люди просто не смотрели раньше и которые мы только недавно обнаружили, они важны», — сказал Драбкин, заведующий кафедрой клинической онкологии Мэри Гилбрет в MUSC. «Обычно мы сначала находим большие вещи, а затем работаем на более глубоких уровнях, а это требует времени.
Как говорится,« дьявол кроется в деталях », а деталей много».Команда была привлечена к исследованию NRP2b по результатам экспериментов, которые они проводили с мощным супрессором опухолей семафорином 3F (SEMA3F), который использует NRP2 в качестве рецептора. При анализе экспрессии NRP2 они неожиданно наблюдали двойную полосу, и эта индукция, по-видимому, влияла на одну полосу больше, чем на другую. Это заставило их задуматься, почему одна группа изменилась больше, чем другая.
Кроме того, они обнаружили, что во время прогрессирующих изменений, которые приводят к метастазированию опухоли, SEMA3F теряется.«Итак, мы спросили, что с ним происходит? Куда он девается?
И мы обнаружили, что во время прогрессирования рака легких SEMA3F теряется и индуцируется NRP2b», — пояснил Геммилл. «Это привело нас к исследованию изоформы 2b, чтобы увидеть, что она делает, потому что никто не знал».С этой целью команда разработала серию экспериментов.
Анализы полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени показали, что стимуляция TGF-бета существенно увеличивает NRP2b, но не NRP2a. Это был первый случай, когда было показано, что повышающая регуляция NRP2 с помощью TGF-бета преимущественно включает неисследованную изоформу 2b. Затем они изучили миграцию опухолевых клеток и паттерны инвазии и обнаружили, что миграция раковых клеток через мембраны, покрытые матригелем, ингибируется в моделях нокдауна NRP2b и усиливается нокдауном NRP2a.Повторные эксперименты подтвердили, что TGF-бета-опосредованная миграция и инвазия раковых клеток зависят от NRP2b.
Именно тогда команда осознала, что две изоформы имеют очень разные функции с точки зрения прогрессирования рака, что побудило их расширить свои исследования на модели животных in vivo.«Как только мы увидели результаты миграции, мы поняли, что должны применить их к животной модели с использованием линий раковых клеток, где мы могли бы контролировать экспрессию изоформы. Мы подумали:« Это слишком хорошо, чтобы быть правдой », но это было правда, — объяснил Геммилл. «Раз за разом мы получали одни и те же результаты.
Всякий раз, когда мы экспрессировали NRP2b, рак метастазировал, и всякий раз, когда мы выражали NRP2a, прогрессирование и метастазирование подавлялись. Очевидно, что с изоформой 2b мы обнаружили что-то, что способствует метастазированию».«Другие люди рассматривали NRP как корецепторы, но никогда не вдавались в подробности того, какая изоформа играет какую роль», — сказал Драбкин. «Это что-то вроде детективной работы.
Вы следите за наводками и задаете вопросы. Иногда вы следуете ложным указаниям — но в этом случае мы обнаружили что-то новое, что оказалось важным».Дополнительные эксперименты показали, что опухолевые сферы раковых стволовых клеток, которые обладают высокой онкогенностью и устойчивы к химио- и лучевой терапии, были значительно уменьшены в моделях нокдауна NRP2b.В частности, значительно меньшее количество клеток развило устойчивость к химиотерапии гефитинибом в моделях, которые нокаутировали NRP2b (то есть в опухолевой среде с очень низким уровнем 2b), и значительно большее количество клеток развило устойчивость к нокауту NRP2a (то есть в опухолевой среде с очень низким уровнем 2a).
Наконец, исследователи изучили образцы тканей человека и обнаружили, что содержание NRP2b в опухолях легких человека коррелирует с более высокой стадией рака и более продвинутым прогрессированием.«ЕМТ вызывает полное изменение репертуара факторов роста и рецепторов. В опухолях, в которых применяется ЕМТ, наблюдается большая сопротивляемость лечению», — пояснил Драбкин. «Мы обнаружили, что в этих эпителиальных опухолях, если мы блокируем NRP2 — особенно белок 2b — на поверхности клетки, они просто не реагируют никаким образом, как контрольные клетки, с точки зрения их способности принимать ЭМП. "«Честно говоря, я был очень, очень удивлен тем, насколько сильно отличались эти две изоформы», — сказал Геммилл. «Когда мы впервые поняли, что существует дифференциальная экспрессия, я подумал, что нам придется очень внимательно посмотреть, чтобы найти некоторые очень незначительные различия.
Тот факт, что они были противоположностями — одно препятствовало, а другое способствовало миграции раковых клеток — и что это различие уменьшилось так быстро было поразительно, потому что существует такой короткий список отличий этих двух изоформ ».Хотя еще многое предстоит узнать о том, как NRP2a и NRP2b функционируют как в нормальных тканях, так и при раке, эти открытия открывают новые возможности для потенциальных методов лечения. Возможности варьируются от разработки моноклональных антител для нацеливания на изоформу 2b до иммунотерапии и использования NRP2b в качестве биомаркера для прогнозирования ответов пациентов на определенные виды лечения.Геммилл ожидает, что после своих открытий исследователи начнут изучать роль NRP2b в других областях заболеваний.
«Я думаю, что многие люди, прочитав эту статью, сядут и скажут:« Интересно, что это делает в моей системе? », — сказал Геммилл. «Например, фиброз часто связан с ответом TGF-бета, и теперь мы знаем, что TGF-бета индуцирует NRP2b. Так что, возможно, NRP2b играет роль в фиброзе, который влияет на почки, печень и легкие».Оба исследователя согласны с тем, что эта работа демонстрирует, как важно не отказываться от мелких, но надоедливых открытий.
Геммилл отмечает, что многие из крупнейших достижений науки начинаются с того, что один человек сидит в лаборатории и занимается одним, на первый взгляд незначительным, явлением.«Если вы видите что-то не совсем правильное, не игнорируйте это», — сказал Геммилл. «Это захватывающее открытие, которое произошло благодаря тому, что мы не упустили ни одной детали».
«Вот так мы узнаем, что на самом деле происходит в системе», — сказал Драбкин. "Если вы проработаете достаточно деталей, вы начнете видеть, как вещи взаимодействуют. Чем больше вы узнаете, тем больше вы увидите, как вещи взаимосвязаны и где находятся точки поворота, которые могут иметь биологические последствия. Прогресс происходит постепенно, пока мы находим слабость, на которую можем направить терапию ».