Химия «выбирай и смешивай» для выращивания культур биоактивных молекул

Цюрих, Швейцария и Нагоя, Япония — профессор Джеффри Боде из ETH-Zurich и Института трансформирующих биомолекул (ITbM) Университета Нагоя и его коллеги разработали новую стратегию, называемую «синтетическая ферментация», для быстрого синтеза большое количество биоактивных молекул, которые можно напрямую проверить в биологических анализах, просто смешав несколько строительных блоков в водной среде. При использовании высокоселективного амидообразующего лигирования реакция протекает с высокой эффективностью в отсутствие организмов, ферментов или реагентов. Продукты ферментации могут быть проверены непосредственно на биологическую активность без какой-либо очистки. Синтетическая ферментация позволила получить около 6000 неприродных пептидоподобных молекул всего из 23 строительных блоков.

Практичность этого подхода демонстрируется путем определения биоактивного соединения для ингибирования фермента, ответственного за репликацию вируса гепатита С. Ожидается, что это исследование, опубликованное в Интернете 7 сентября 2014 г. в журнале Nature Chemistry как расширенная онлайн-публикация, станет мощным и практичным методом, позволяющим быстро генерировать и проверять активные молекулы, полезные для открытия лекарств и других промышленных приложений, а также для простых биологические анализы на месте.Микробная ферментация — это метаболический процесс, при котором микробы синтезируют сложные органические вещества, такие как антибиотики, из простых органических строительных блоков.

Этот процесс известен как один из самых успешных методов обнаружения биологически активных соединений. «Мы были вдохновлены подходом природы к быстрому генерированию сложных молекул путем микробной ферментации, поэтому мы рассмотрели возможность использования синтетической органической химии для подготовки и скрининга библиотек биоактивных пептидов, метод, который мы называем синтетической ферментацией», — говорит профессор Боде, возглавлявший исследование. Органический синтез часто включает в себя множество этапов, требующих больших затрат времени, использование токсичных реагентов для инициирования реакции и требует сложной очистки перед биологическим скринингом. «Вместо того, чтобы использовать реагенты или ферменты для объединения простых строительных блоков в сложные молекулы, мы решили синтезировать такие молекулы путем синтетической ферментации с нашими химическими реакциями с использованием тщательно разработанных прекурсоров», — говорит профессор Боде. Для этого профессор Боде применил свое уникальное лигирование KAHA (α-кетокислота-гидроксиламин), разработанное его группой в 2006 году. Лигирование KAHA обеспечивает высокоэффективное связывание между молекулой α-кетокислоты и молекулой гидроксиламина путем образования амида (N (H) C = O) связь в водной среде без каких-либо дополнительных реагентов.

Синтетическая ферментация, в которой используется химия лигирования KAHA, позволяет создавать библиотеки соединений, которые было бы сложно получить либо традиционным органическим синтезом, либо микробной ферментацией.При синтетической ферментации молекула инициатора α-кетокислоты (I) смешивается с изооксазолидиновыми мономерами удлинения (M), которые создают цепи пептидов, что, наконец, останавливается добавлением строительного блока терминатора (T). Новая α-кетокислота генерируется каждый раз, когда к растущей пептидной цепи добавляется мономер (M), который реагирует с другим мономером (M), приводя к пептидам различной длины и последовательности.

После добавления молекулы терминатора (Т) пептидная цепь не может расти дальше. «Изначально мы решили работать с 23 строительными блоками, включая 6 инициаторов (I), 8 мономеров (M) и 9 терминаторов (T), что может привести к получению около 30 000 соединений из всех возможных комбинаций строительных блоков. В этом исследовании Мы сделали 6000 соединений с помощью выбранных комбинаций. Увеличивая количество строительных блоков, мы можем значительно увеличить количество потенциальных соединений, которые могут быть образованы », — объясняет профессор Боде.

Полученная «культура», содержащая пептидные цепи, побочные продукты циклогексанона и небольшие количества молекулы терминатора (Т), которая добавляется в небольшом избытке, может быть разбавлена ​​буфером и непосредственно подвергнута биологическому скринингу. «Насколько нам известно, в настоящее время не существует синтетического метода для получения такого большого количества соединений из относительно небольшого количества исходных материалов путем простого смешивания строительных блоков с последующими прямыми биологическими анализами», — говорит профессор Боде.Группа Боде демонстрирует применимость синтетической ферментации путем приготовления синтетических культур и их скрининга для поиска биологически активных молекул свинца для ингибирования протеазы ВГС (вируса гепатита С).

Протеаза ВГС — это фермент, играющий ключевую роль в репликации вируса гепатита С. Поскольку у этого фермента нет четко очерченного кармана в его активном сайте, это сложная мишень для поиска биоактивных молекул-мишеней. «Мы« выращивали »наши культуры для скрининга с использованием различных комбинаций инициаторов (I), мономеров (M) и терминаторов (T), и проводили анализы в лунках. По результатам анализа мы удалили плохо функционирующие части и быстро деконволюционировали смеси, обнаруженные в активных лунках, для определения комбинаций компонентов, которые приводят к активным продуктам », — описывает профессор Боде.Профессор Боде говорит: «Самая сложная часть этой работы заключалась в том, чтобы выйти за рамки укоренившейся идеи о том, что нам нужны отдельные чистые соединения для проведения биологического скрининга.

Это произошло только тогда, когда мы посмотрели на то, как Природа создает новые лекарства — производя десятки похожие соединения вместе — что мы поняли, что можем использовать нашу химию, чтобы сделать что-то очень похожее. Вдохновленные этим, мы обнаружили, что можем сделать тысячи соединений из нескольких строительных блоков за несколько часов, а не за месяцы, как обычно брать."

Синтетическая ферментация позволяет быстро образовывать огромное количество соединений из легкодоступных строительных блоков, которые можно исследовать, чтобы найти активные молекулы-мишени. «В ITbM мы надеемся применить этот подход для фенотипических анализов, чтобы с помощью биологов идентифицировать небольшие молекулы, которые изменяют характеристики клеток и организмов», — говорит профессор Боде. Подход синтетической ферментации также может быть полезен в областях материаловедения и катализа для идентификации сильнодействующих пептидов. «Эти исследования показывают, что, просто смешивая соединения, любой может создавать новые молекулы и тестировать их с помощью простых биологических тестов, таких как противогрибковые или антибактериальные скрининги.

Это возможно благодаря нашей уникальной химии лигирования KAHA, разработанной в нашей группе. Наша идея состоит в том, чтобы предоставить быстрый способ получения биоактивных молекул, просто смешивая компоненты в воде. Мы хотели бы использовать это как платформу для химии, которую может делать каждый, включая ученых из других областей, старшеклассников и фермеров.

Кто угодно может подготовьте библиотеки за несколько часов с помощью микропипетки, исследуйте различные комбинации строительных блоков и условий культивирования вместе с простыми анализами, чтобы найти новые молекулы », — говорит профессор Боде.

Портал обо всем