Гены содержат код ДНК для производства всех белков клетки. Чтобы начать этот процесс, сначала необходимо транскрибировать гены из ДНК в РНК. Для этого требуется огромное семейство ДНК-связывающих белков, называемых факторами транскрипции, которые, учитывая их важность в экспрессии генов, представляют сегодня огромный интерес для биологов.
Однако из-за их огромного количества, их способности объединяться в разные пары и технической сложности изучения их ДНК-связывающих свойств в лаборатории, мы все еще очень мало знаем о многих факторах транскрипции, несмотря на прилагаемые усилия. Теперь ученые EPFL разработали метод, основанный на микрофлюидике, который может значительно ускорить процесс с минимальным количеством необходимых материалов, и который может быть распространен на другие молекулы и исследования, например анализ белок-РНК взаимодействий. Опубликовав в Nature Methods, исследователи уже использовали эту технику для определения свойств связывания ДНК более 60 факторов транскрипции, включая девять новых.
Факторы транскрипцииМлекопитающие, включая людей, имеют от 1300 до 2000 факторов транскрипции, многие из которых объединяются с другими в «гетеродимеры», чтобы связывать гены и индуцировать их транскрипцию в РНК. Поскольку один фактор транскрипции может сочетаться с разными в зависимости от типа клеток, в которых они активны, количество возможных комбинаций может быть очень большим.Но недостаточно просто знать идентичность факторов транскрипции и то, какие из них образуют пары; нам также необходимо понять их ДНК-связывающие свойства, такие как их сродство и специфичность к ДНК — и это также включает гетеродимеры.
Это ключ к успеху, если мы когда-либо собираемся использовать факторы транскрипции в биотехнологических или фармацевтических целях в будущем. Но это также очень сложно сделать экспериментально, поскольку для этого требуются относительно большие количества трудно производимых факторов транскрипции.Короче говоря, профилирование факторов транскрипции — непростая и очень сложная задача. Существует несколько баз данных, в которых перечислены свойства связывания ДНК, но в целом они охватывают только около 500 отдельных факторов транскрипции и только часть гетеродимеров, которые оцениваются в диапазоне от 3000 до 25000.
Понятно, что прогресс в этой области медленный, и доступные профили в этих базах данных, как правило, имеют только медицинскую количественную ценность с точки зрения прогнозирования генов-мишеней для этих факторов транскрипции.Микрофлюидный подходЛаборатория Барта Депланке в Институте биотехнологии EPFL изобрела новую технику под названием SMiLE-seq, которая может значительно ускорить процесс, требуя лишь крошечных количеств факторов транскрипции. В этой технике используется микрофлюидика, наука об управлении крошечными количествами жидкости в столь же крошечных пространствах.
Микрофлюидика быстро становится областью передового опыта в EPFL, объединяя множество различных областей и дисциплин.SMiLE-seq работает путем присоединения небольших количеств фактора транскрипции (или факторов при исследовании гетеродимеров) в микрофлюидное устройство — это чип с каналами микрометрового размера, которые позволяют жидкости проходить через него. Как только факторы транскрипции прикрепляются к поверхности чипа, большая библиотека случайной ДНК аккуратно закачивается в чип и протекает по ним.
Это позволяет факторам транскрипции распознавать соответствующие им последовательности ДНК. После этого комплекс фактора транскрипции-ДНК физически захватывается путем опускания кнопки с микрофлюидным управлением, в то время как несвязанная ДНК просто смывается.Затем связанную ДНК снимают с устройства и подготавливают к секвенированию, чтобы определить, какая часть ее была захвачена факторами транскрипции. Эта информация вводится в специализированное программное обеспечение, которое позволяет исследователям определять ДНК-связывающие свойства факторов транскрипции или гетеродимеров.
В свою очередь, это помогает лучше предсказать их профили связывания ДНК in vivo.Использование микрофлюидики в SMiLE-seq дает три основных преимущества: во-первых, оно сокращает количество факторов транскрипции, необходимых для этого типа экспериментов, поскольку для этого нужны только их пикограммы. Во-вторых, это значительно ускоряет процесс — с нескольких дней до менее чем часа. И, наконец, SMiLE-seq не ограничивается ни длиной целевой последовательности ДНК, ни смещением в сторону более сильных аффинных взаимодействий белок-ДНК, как это могут быть современные методы.
Команда Депланке использовала SMiLE-seq на 67 полноразмерных факторах транскрипции человека, мыши и дрозофилы, успешно проанализировав некоторые из них, которые ранее никогда не изучались. В будущем он намеревается использовать универсальность этой техники в других молекулах, таких как РНК.
Его команда подала патент, и в настоящее время разрабатывается стартап, чтобы внедрить технологическую концепцию SMiLE-seq в коммерческий мир.