Если ДНК — это план жизни, то РНК — это строительный подрядчик, который ее интерпретирует, поэтому секвенирование РНК расскажет вам, что на самом деле происходит внутри клетки.
Специалисты по геномике Брентон Грейвли из Института системной геномики при Университете Конна, научный сотрудник Мохан Болисетти и аспирант Гопинат Раджадинакаран объединились с британской Oxford Nanopore Technologies, чтобы показать, что секвенатор нанопор MinION компании может секвенировать гены быстрее, лучше и с гораздо меньшими затратами. стоимость, чем стандартная технология. Они опубликовали свои выводы в сентябре.
30 в геномной биологии.
Если бы ваш геном был библиотекой, а каждый ген был бы книгой, некоторые гены было бы просто читать, но некоторые были бы больше похожи на роман «Выбери свое собственное приключение».
Исследователи часто хотят знать, какая версия гена на самом деле экспрессируется в организме, но для сложных генов, основанных на выборе собственного приключения, это было невозможно.
Грейвли, Болисетти и Раджадинакаран решили головоломку в двух частях. Во-первых, нужно было найти лучшую технологию секвенирования генов.
Чтобы секвенировать ген с помощью старой существующей технологии, исследователи сначала делают множество его копий, используя ту же химию, которую использует наш организм. Затем они измельчают копии гена на крошечные кусочки, читают каждый крошечный фрагмент, а затем, сравнивая все разные фрагменты, пытаются выяснить, как они были изначально собраны вместе. Методика зависит от вероятности того, что не все копии будут разделены на одинаковые части.
Представьте себе, что вы смотрите разные сцены из фильма, не по порядку. Если вы затем посмотрели один и тот же фильм, но нарезали сцены в немного разных местах, вы могли бы сравнить две версии и начать выяснять, какие сцены связаны с какими.
Этот метод не сработает для генов «выбери свое собственное приключение», потому что, если вы скопируете их так, как это делает тело, с помощью РНК, каждая копия может немного или сильно отличаться от следующей. Такие разные версии одного и того же гена называются изоформами. Когда разные изоформы измельчаются и секвенируются, становится невозможно точно сравнить части и выяснить, с каких версий гена вы начали.
Если бы ген был фильмом, «вы не смогли бы сказать, что сцены 1 и 2 присутствовали вместе», — говорит Болисетти.
Затем в прошлом году почти невозможное внезапно стало возможным. Oxford Nanopore, компания, базирующаяся в Великобритании, выпустила свой новый секвенсор нанопор и предложила его лаборатории Грейвли.
Секвенсор нанопор, называемый MinION, работает, пропитывая одну нить ДНК через крошечную пору. Пора может одновременно содержать только пять оснований ДНК — « букв », обозначающих наши гены.
Есть четыре основания ДНК, G, A, T и C, и 1024 возможных комбинации из пяти оснований. Каждая комбинация создает различный электрический ток в нанопоре.
GGGGA производит другой ток, чем AGGGG, который снова отличается от CGGGG. Пропитывая ДНК через поры и записывая полученный сигнал, исследователи могут считывать последовательность ДНК.
Для второй части решения Грейвли, Болисетти и Раджадинакаран решили пойти дальше. Вместо секвенирования любого старого гена «выбери свое собственное приключение» они выбрали наиболее сложный из известных — молекулу клеточной адгезии 1 с синдромом Дауна (Dscam1), которая контролирует проводку мозга у дрозофил.
Dscam1 обладает потенциалом создания 38 016 возможных изоформ, и каждая плодовая мушка может создать каждую из них, но сколько из этих версий фактически создано, остается неизвестным.
Dscam1 выглядит так: X-12-X-48-X-33-X-2-X, где X обозначают разделы, которые всегда одинаковы, а числа указывают разделы, которые могут отличаться (само число показывает, сколько разных вариантов есть для этого раздела).
Чтобы изучить, сколько различных изоформ Dscam1 на самом деле существует в мозгу мухи, исследователям сначала пришлось преобразовать РНК Dscam1 в ДНК.
Если ДНК — это книга или набор инструкций, то РНК — это транскрибер, который копирует книгу, чтобы ее можно было преобразовать в белок. ДНК включает инструкции для всех 38 016 изоформ гена Dscam1, в то время как каждая отдельная РНК Dscam1 содержит инструкции только для одной. Никто еще не использовал MinION для секвенирования копий РНК, и хотя было вероятно, что это можно сделать, демонстрация его и демонстрация того, насколько хорошо он работает, будет значительным достижением в этой области.
Раджадинакаран взял мозг плодовой мушки, извлек РНК, преобразовал ее в ДНК, выделил копии ДНК РНК Dscam1, а затем прогнал их через нанопоры MinION. В этом одном эксперименте они не только обнаружили, что 7 899 из 38 016 возможных изоформ Dscam1 были экспрессированы, но также и что многие другие, если не все версии, вероятно, экспрессировались.
«Многие люди говорили, что MinION никогда не будет работать», — говорит Грейвли, — но мы показали, что он работает с использованием самого сложного из известных генов."
Исследование демонстрирует, что технология секвенирования генов теперь доступна гораздо более широкому кругу исследователей, чем это было возможно ранее, поскольку MinION относительно недороги и легко переносятся, поэтому практически не требует места в лаборатории.
«Этот вид передовой работы ставит Калифорнийский университет в авангард развития технологий и укрепляет наш портфель геномных исследований», — говорит Марк Лаланд, директор Института системной геномики Калифорнийского университета. "Кроме того, благодаря инвестициям в геномику в рамках академического плана университета Брент Грейвли может использовать свой опыт, чтобы преподаватели и студенты в наших кампусах успешно конкурировали за гранты и запускали предприятия в области бионауки."
Грейвли расскажет об исследовании на собрании сообщества Oxford Nanopore MinION в Нью-Йоркском Центре генома в декабре.
3.
Что касается следующих шагов, исследователи планируют пойти еще дальше: секвенировать каждый бит РНК от начала до конца внутри одной клетки, что невозможно сделать с помощью традиционных секвенаторов генов.
«Эта технология обладает удивительным потенциалом для преобразования того, как мы изучаем биологию РНК, и типа информации, которую мы можем получить», — говорит Грейвли. "Плюс тот факт, что MinION — это ручной секвенсор, который вы подключаете к ноутбуку, просто невероятно круто!"