Этот метод, разновидность «широкополосного когерентного антистоксова комбинационного рассеяния света» (BCARS), является достаточно быстрым и точным, чтобы позволить исследователям создавать изображения биологических образцов с высоким разрешением, содержащие подробную пространственную информацию о конкретных биомолекулах, присутствующих на очень высоких скоростях. По мнению команды NIST, этого достаточно, чтобы наблюдать изменения и движение в живых клетках.Рамановская спектроскопия основана на тонком взаимодействии света и молекул. Молекулы имеют характерные частоты колебаний, связанные с их атомами, изгибающимися и растягивающими молекулярные связи, удерживающие их вместе.
При правильных условиях фотон, взаимодействующий с молекулой, будет поглощать часть этой энергии от определенной вибрации и выходить со своей частотой, смещенной на эту частоту — это «антистоксово рассеяние». Регистрация достаточного количества этих фотонов с усиленной энергией показывает характерный спектр, уникальный для молекулы. Это отлично подходит для биологии, потому что в принципе он может идентифицировать и различать многие сложные биомолекулы, не разрушая их, и, в отличие от многих других методов, не изменяет образец пятнами, флуоресцентными или радиоактивными метками.Использование этой внутренней спектральной информации для картирования определенных видов биомолекул на изображении потенциально очень мощно, но уровни сигналов очень слабые, поэтому исследователи годами работали над усовершенствованными методами сбора этих спектров.
В «когерентных» методах комбинационного рассеяния используются специально настроенные лазеры для возбуждения молекулярных колебаний и обеспечения яркого источника зондирующих фотонов для считывания колебаний. Это частично решило проблему, но разработанные к настоящему времени методы когерентного комбинационного рассеяния обладали ограниченными возможностями доступа к большей части доступной спектроскопической информации.
Большинство современных методов когерентного комбинационного рассеяния позволяют получить полезный сигнал только в спектральной области, содержащей приблизительно пять пиков с информацией о связях углерод-водород и кислород-водород. Усовершенствованный метод, описанный командой NIST, не только получает доступ к этой спектральной области, но также получает отличный сигнал из спектральной области «отпечатков пальцев», которая имеет примерно 50 пиков — большую часть полезной информации о молекулярном идентификаторе.
Инструмент NIST может получить усиленный сигнал в значительной степени за счет эффективного использования возбуждающего света. Обычные приборы для когерентного комбинационного рассеяния должны настраивать две отдельные частоты лазера для возбуждения и считывания различных мод комбинационных колебаний в образце. В приборе NIST используются ультракороткие лазерные импульсы для одновременного возбуждения всех интересующих колебательных мод.
Это «внутриимпульсное» возбуждение чрезвычайно эффективно и дает самые сильные сигналы в области отпечатков пальцев. «Слишком много света разрушит клетки», — объясняет химик NIST Маркус Цицероне. «Таким образом, мы разработали очень эффективный способ генерации нашего сигнала с ограниченным количеством света. Мы были более эффективными, но и более эффективными там, где это важно. в области отпечатка пальца ".
Рамановские гиперспектральные изображения создаются путем получения спектров, по одному пространственному пикселю за раз. 100-кратное улучшение мощности сигнала для инструмента NIST BCARS позволяет собирать отдельные спектральные данные намного быстрее и с гораздо более высоким качеством, чем раньше — несколько миллисекунд на пиксель для высококачественного спектра по сравнению с десятками миллисекунд для предельного значения. спектр качества с другими когерентными спектроскопиями комбинационного рассеяния, или даже секунды для спектра от более традиционных инструментов спонтанного комбинационного рассеяния.
Поскольку он способен регистрировать гораздо больше спектральных пиков в области отпечатка пальца, каждый пиксель несет в себе множество данных о присутствующих биомолекулах. Это приводит к формированию изображений с высоким разрешением в течение минуты или около того, тогда как, как отмечает инженер-электрик NIST Чарльз Кэмп-младший, «нередко требуется 36 часов для получения изображения с низким разрешением при спонтанной рамановской спектроскопии».
«В этой статье есть ряд нововведений в области рамановской спектроскопии», — добавляет Кэмп. «Среди прочего, мы показываем подробные изображения коллагена и эластина — обычно не идентифицируемые с помощью когерентных методов комбинационного рассеяния — и множественные пики, приписываемые различным связям и состояниям нуклеотидов, которые показывают присутствие ДНК или РНК».