CRISPR / Cas9, первоначально обнаруженный как противовирусная система у бактерий, сегодня является одной из самых горячих тем в генетических исследованиях. Разработав версию этой системы, исследователи могут как редактировать последовательности ДНК, так и контролировать, какие гены используются.
Однако предыдущие исследования показали, что редактирование последовательностей ДНК человека с помощью системы не всегда так точно, как хотелось бы исследователям. Эти результаты вызвали опасения по поводу использования технологии CRISPR в изучении болезней человека.
В качестве потенциального решения некоторые исследователи добавили в систему большей гибкости, используя CRISPR для нацеливания на участки ДНК, которые контролируют, какие гены активны. Но вместо того, чтобы использовать часто используемый генетический режущий инструмент Cas9, они инактивировали режущую функцию Cas9 и прикрепили белки, которые контролируют упаковку генома.
Распутывая или плотно связывая эти области генома, они могли эффективно включать и выключать их.
Хотя было показано, что этот метод работает хорошо, не было исследовано, оказывает ли он нецелевое воздействие. Теперь команда исследователей из Университета Дьюка показала, что эти методы контроля генов обладают высокой степенью точности, необходимой для фундаментальной науки и медицинских исследований.
Исследование будет опубликовано 26 октября 2015 года в журнале Nature Methods.
«Основное преимущество CRISPR по сравнению с предыдущими технологиями — это возможность использовать генетический скальпель, а не кувалду», — сказал Чарльз Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Дьюка. "Многие лаборатории по всему миру используют эти инструменты, исходя из предположения, что они получают определенный эффект, но не было проведено всестороннего анализа, чтобы доказать это.
Эти эксперименты демонстрируют исключительную специфичность, демонстрируя, что технология способна воздействовать на отдельные последовательности генома."
Возможность управлять переключениями генома будет особенно важна для изучения и потенциального лечения заболеваний человека, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные состояния и диабет, которые могут быть вызваны мутациями в контролирующих областях генома. Есть надежда, что переопределение одного из этих переключателей может выявить и устранить первопричины многих заболеваний.
Это также может помочь исследователям понять и изменить реакцию разных людей на лекарства.
Но только если техника CRISPR достаточно специфична.
Вскоре после того, как CRISPR был впервые описан для редактирования генов человека, в нескольких статьях было показано, что этот метод иногда может иметь нецелевые эффекты.
Это создает проблемы для методов генной терапии и фундаментальных научных проектов, когда исследователи хотят изменить функцию определенных генов, не вызывая непредвиденных побочных эффектов.
Была разработана альтернативная стратегия для включения и выключения геномных областей, которые контролируют использование генов, без изменения последовательности ДНК вообще. В некоторых случаях эти переключатели могут управлять сразу несколькими связанными генами, что позволяет исследователям брать аккорды вместо отдельных нот.
«Глядя на специфику этих инструментов, технически очень сложно», — сказал Тимоти Редди, доцент кафедры биостатистики и биоинформатики Duke. "Обнаружить изменение в последовательности или активности гена относительно просто, если вы сосредотачиваетесь на одной концентрированной области генома. Но чтобы посмотреть, как выключение одного переключателя энхансера влияет на активность и структуру всего генома, требуются более специализированные методы."
Герсбах обратился к Редди и коллеге Грегори Кроуфорду, которые все вместе работают в соседних лабораториях и офисах Центра геномной и вычислительной биологии Дьюка, за помощью в этих более специализированных методах.
Редди сосредоточил свою карьеру на изучении того, как переключатели генов работают в геноме человека, как эти переключатели различаются между людьми, и последствия этих открытий для человеческих качеств и болезней.
Кроуфорд, доцент педиатрии, потратил более десяти лет на разработку методов определения контрольных областей в геноме и того, как они различаются между типами клеток, во время развития или в ответ на лечение лекарствами.
«Современные методы контроля переключателей генов, включая лекарства, используемые в клинических испытаниях, изменяют активность многих переключателей генома одновременно, создавая тысячи нецелевых эффектов», — сказал Кроуфорд. "Что крайне необходимо, так это технология для управления одним элементом за раз."
Пратикше Такоре, аспиранту лаборатории Герсбаха, пришлось объединить опыт всех трех лабораторий для изучения специфики CRISPR в управлении этими переключателями.
Хотя результаты не могут доказать, что каждый эксперимент будет иметь одинаковый высокий уровень точности, они предоставляют исследователям план для оценки этих эффектов.
«Объединив геномику и геномную инженерию, мы разработали метод всестороннего исследования того, как работает эта система генетического подавления, а также предложили способы использования этой технологии в будущем», — сказал Такор. «Мы также узнали кое-что новое о регуляции генов, и оказалось, что в этом контексте CRISPR может достичь гораздо более высокого уровня специфичности, чем мы ожидали."\