Теперь исследователи разработали и протестировали новый метод, известный как ribose-seq, который позволяет им определять полный профиль рибонуклеотидов, встроенных в геномную ДНК. Используя ribose-seq, они обнаружили широко распространенное, но не случайное включение и «горячие точки», где вставки РНК накапливаются в ядерной и митохондриальной ДНК обычно изучаемых видов почкующихся дрожжей.
Ribose-seq может быть использован для обнаружения рибонуклеотидов в ДНК широкого круга других организмов, в том числе человека.
«Рибонуклеотиды — это самые распространенные нестандартные нуклеотиды, которые можно найти в ДНК, но до сих пор не существовало системы, позволяющей определить, где они расположены в ДНК или конкретно определить, к какому типу они относятся», — сказала Франческа Сторичи. доцент Школы биологии Технологического института Джорджии. "Поскольку они меняют способ работы ДНК, как в ее структуре, так и в функциях, важно знать их личность и места их включения в геном."
Описание метода рибоза-seq и того, что он обнаружил в ДНК видов почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, будет опубликовано 26 января в журнале Nature Methods. Результаты стали результатом сотрудничества исследователей лаборатории Сторичи в Технологическом институте Джорджии с аспирантами Кьюнг Дук Кох и Сатья Балачандер, а также в Медицинской школе Аншутца при Университете Колорадо с доцентом Джеем Хессельбертом.
Исследование было поддержано Национальным научным фондом, Исследовательским альянсом Джорджии, Американским онкологическим обществом, Фондом исследований рака Дэймона Руньона и Университетом Колорадо «Игроки в гольф против рака».
Из-за дополнительной гидроксильной (ОН) группы в рибонуклеотидах их присутствие искажает ДНК и создает чувствительные участки, где могут происходить реакции с другими молекулами.
Особый интерес представляют реакции между ОН и щелочными растворами, которые могут сделать ДНК более восприимчивой к расщеплению.
Ribose-seq использует преимущества этой реакции с гидроксильной группой для запуска процесса идентификации геномного спектра включения рибонуклеотидов.
Исследователи сначала расщепляют образцы ДНК по рибонуклеотидам, а затем проводят полученные фрагменты с помощью специального процесса, который завершается созданием библиотеки последовательностей ДНК, которые содержат сайты включения рибонуклеотидов и их предшествующие последовательности. Высокопроизводительное секвенирование библиотеки и сопоставление считываний секвенирования с эталонным геномом позволяет определить профиль событий включения rNMP.
«Рибоза-seq специфична для прямого захвата рибонуклеотидов, встроенных в ДНК, и не захватывает праймеры РНК или фрагменты Окадзаки, образующиеся во время репликации ДНК, разрывы или базовые сайты в ДНК», — отметил Сторичи.
«По этой причине рибоза-seq может применяться для картирования rNMP в любой геномной ДНК, от крупных ядерных геномов до небольших геномных молекул, таких как плазмиды и митохондриальная ДНК, без необходимости в процедурах стандартизации», — сказала она. «Это также позволяет картировать rNMPs даже в условиях, в которых ДНК подвергается воздействию стрессоров окружающей среды, которые повреждают ДНК, создавая разрывы и / или базовые сайты."
По словам Коха, первого автора статьи, дополнительная гидроксильная группа, обнаруженная в рибонуклеотидах, является ключом к технике рибозы-секвенирования. «Группа ОН специфична для рибонуклеотидов», — пояснил он. "Это позволило нам создать новый инструмент для точного определения местоположения рибонуклеотидов."
Высокопроизводительное секвенирование и анализ исходных данных были выполнены в лаборатории Хессельберта на кафедре биохимии и молекулярной генетики Медицинской школы Аншутца при Университете Колорадо.
Чтобы проверить свой метод, исследователи проверили последовательность рибозы на хорошо изученных видах дрожжей. Анализ показал сильное предпочтение цитидиновых и гуанозиновых оснований в рибонуклеотидных сайтах.
«Рибонуклеотиды не распределены случайным образом, и есть некоторые предпочтения для конкретных последовательностей оснований и конкретного состава оснований самого рибонуклеотида», — сказал Ко. «Посмотрев на неслучайное распределение, мы обнаружили несколько горячих точек, в которых рибонуклеотиды включены в геном."
Знание того, где находится кластер рибонуклеотидов, может помочь определить области с наибольшим потенциалом нестабильности генома и привести к лучшему пониманию того, как они влияют на свойства и активность ДНК.
«Тот факт, что мы видим смещения в составе оснований рибонуклеотидов, позволяет нам сказать, какое основание с большей вероятностью будет включено в ДНК», — пояснил Кох. "Если есть определенные признаки нестабильности генома, которые вызваны рибонуклеотидами, это позволит нам сузить области и узнать, где они с большей вероятностью могут быть обнаружены."
По словам Коха, следующим шагом будет тестирование последовательности рибозы на других ДНК. «Наш метод потенциально может быть применен к любому геному любого типа клеток любого организма, если из него может быть извлечена геномная ДНК», — добавил он. "Это не зависит от конкретных организмов."
Помимо процессов репарации и репликации, рибонуклеотиды могут также образовываться в ДНК в результате повреждений, вызванных лекарствами, факторами окружающей среды и другими факторами. Метод рибозы-секвенирования также может позволить ученым изучить влияние этих процессов.
«Ribose-seq должен позволить нам лучше понять влияние рибонуклеотидов на структуру и функцию ДНК», — сказал Сторичи. «Выявление конкретных признаков включения рибонуклеотидов в ДНК может представлять новые биомаркеры таких заболеваний человека, как рак, и других дегенеративных расстройств."
Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом (NSF) под номером гранта MCB-1021763, Исследовательским альянсом Джорджии под номером R9028, Американским онкологическим обществом, Фондом исследований рака Дэймона Руньона и Университетом США. Колорадские игроки в гольф против рака.
Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения спонсирующих агентств.