Новый структурно спроектированный канал наконец-то дает нейробиологам инструменты как для активации, так и для инактивации нейронов в глубоких структурах мозга с помощью тусклых импульсов проецируемого извне света. Карл Дайссерот и его коллеги из Стэнфордского университета опубликовали свои выводы 25 апреля 2014 года в журнале Science. «Мы рады этой повышенной светочувствительности подавления отчасти потому, что мы думаем, что это значительно улучшит работу организмов с большим мозгом, таких как крысы и приматы», — говорит он.
Впервые обнаруженные в одноклеточных зеленых водорослях в 2002 году, канальные родопсины действуют как фоторецепторы, которые направляют движения микроорганизмов в ответ на свет. В историческом исследовании 2005 года Дейссерот и его коллеги описали метод экспрессии светочувствительных белков в нейронах мыши. Посветив на эти нейроны импульс синего света, исследователи показали, что они могут надежно вызвать открытие ионного канала в ядре канала родопсина, позволяя положительно заряженным ионам устремляться в клетку и запускать потенциалы действия. Каналродопсины с тех пор использовались в сотнях исследовательских проектов, посвященных нейробиологии всего, от динамики клеток до когнитивных функций.
Несколькими годами позже появились галородопсины, светочувствительные белки, селективные в отношении отрицательно заряженного хлорида иона. Эти белки, полученные из галобактерий, предоставили исследователям инструмент для контролируемой светом инактивации нейронов. Однако основным ограничением этих белков является их неэффективность.
В отличие от канального родопсина, галородопсин представляет собой ионный насос, а это означает, что только один ион хлорида перемещается через мембрану нейрона на фотон света. «Это означает частичное торможение», — говорит Дейссерот. "Вы можете подавлять нейроны, но у живых животных это не всегда."
Поиски естественного светочувствительного канала с порами, проницаемыми для отрицательно заряженных ионов, не увенчались успехом. «Мы искали», — говорит Дейссерот. «Мы провели обширный геномный поиск и нашли много интересных каналов родопсинов и множество насосов, но мы так и не нашли ингибиторный канал в природе."
Бесплодные исследования команды привели их к попытке изменить молекулярную структуру канального родопсина так, чтобы его поры доставляли отрицательные ионы в клетку. «Для этого вам нужно знать, как выглядит пора канала на уровне Ангстрема», — говорит Дейссерот. «Что нам действительно нужно, так это кристаллическая структура с высоким разрешением.«В 2012 году, работая с группой в Японии, Дейссерот и его коллеги запечатлели структуру химеры канального родопсина под названием C1C2 с помощью рентгеновской кристаллографии.
Молекулярный анализ поры канала родопсина показал, что замена определенных отрицательно заряженных аминокислотных остатков, выстилающих поры, положительными остатками может изменить электростатический потенциал канала, делая его более проводящим для отрицательно заряженных ионов, таких как хлорид. Чтобы добиться этого молекулярного переключения, исследователи выполнили десятки одиночных сайт-направленных мутаций.
Несколько мутаций придали селективность по хлориду, но каналы не смогли проводить ток. Итак, команда проверила сотни комбинаций мутаций. «В ходе систематического процесса мы обнаружили сначала комбинацию из четырех мутаций, а затем группу из пяти мутаций, которые, казалось, изменили селективность», — говорит Дейссерот. "Мы соединили их в девятикратно мутировавший канал, и этот канал, что удивительно, был селективным по хлоридам."
Новый канал, получивший название iC1C2 от «ингибирующего C1C2», не только позволяет избирательно прохождение ионов хлорида, но и значительно снижает вероятность возникновения потенциалов действия, делая нейрон более «протекающим», что невозможно в ионных насосах, таких как галородопсин.
Команда Деиссерота произвела финальную мутацию остатка цистеина в iC1C2, которая делает канал бистабильным и на несколько порядков более чувствительным к свету.
При активации синим светом мутировавшие каналы остаются открытыми до нескольких минут за раз, в то время как воздействие красного света на каналы заставляет их быстро закрыться. Этот уровень долгосрочного контроля полезен в исследованиях развития, где события разыгрываются от нескольких минут до часов.
Длительное время открытия канала также означает, что нейроны могут по существу интегрировать потоки хлоридов в более длительных временных масштабах, и, следовательно, более слабый свет может использоваться для подавления нейронов. Повышенная светочувствительность приводит к меньшему повреждению нервной ткани, вызванному светом, способности достигать глубоких структур мозга и возможности контролировать функции мозга, которые затрагивают большие области мозга.
«Это то, к чему мы стремились в течение многих лет, и это действительно кульминация многих потоков работы в лаборатории — работы с кристаллической структурой, мутационной работы, поведенческой работы — все они собраны здесь вместе», — говорит Дейссерот.