«Это исследование выявляет важную стадию и механизм ВИЧ-инфекции, которые ранее недооценивались», — сказал д-р. Брасс, доцент кафедры микробиологии и физиологических систем. "Важно знать больше об этих ранних событиях заражения, чтобы мы могли придумать способы, чтобы вирус не стал частью нашей ДНК и заразил нас на всю жизнь."
Ключ к изучению внутриядерной миграции ВИЧ пришел благодаря новому методу ViewHIV, который был разработан Брассом и его коллегами, Джилл Перрейра и Крис Чин, научными сотрудниками UMMS; и Эрик Фили, докторант Университета Дьюка. Используя ViewHIV, исследователи могут внимательно отслеживать миграцию ВИЧ, который состоит из белковой капсулы или капсида, содержащего ДНК вируса, когда он проходит через ядерную мембрану и перемещается внутри ядра.
До сих пор ученым не удавалось создать хорошие изображения ВИЧ внутри ядра, используя стандартные методы. Из-за этого ограничения большая часть понимания транзита ВИЧ через ядерную мембрану была получена с помощью косвенных методов молекулярной биологии и биохимии, которые оценивают большие популяции клеток.
«Есть определенные характеристики вируса, о которых вы можете узнать, только сохранив его нетронутым и наблюдая за его действием в отдельных клетках», — сказал Перрейра, соавтор исследования. "Исследователи изучали ВИЧ в течение 30 лет, но у нас все еще не было действительно хорошего способа заглянуть внутрь инфицированных клеток.
Мы думали, что если бы мы могли просто увидеть, что происходит, то могли бы лучше понять, что делает вирус и как его остановить."
Чтобы заглянуть внутрь ВИЧ-инфицированных клеток, команда разработала ViewHIV. Адаптированный к существующим технологиям, ViewHIV способен одновременно генерировать изображения вирусного генома и белкового капсида внутри инфицированной клетки-хозяина.
ViewHIV сочетает очень чувствительный тип флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с моноклональным антителом, которое связывается с вирусным капсидом. Ключ, по словам Брасса, заключался в использовании протеазы при подготовке образцов. Это позволило увидеть капсид, помеченный флуоресцентным антителом, на изображениях ядра.
Этот метод позволяет ученым визуализировать движение и судьбу вирусного капсида, ДНК и РНК внутри клетки.
Затем стандартная конфокальная микроскопия используется для получения как горизонтальных, так и вертикальных фотографий клетки, которые повторно собираются в подробные трехмерные изображения клетки.
Перрейра и Чин, используя изображения, созданные ViewHIV, смогли отследить вирус и его капсид, когда он перемещался через цитоплазму, через ядерную мембрану и, наконец, в ядро, где он постоянно интегрируется в ДНК клетки-хозяина. Убивая определенные белки-хозяева, исследователи смогли наблюдать, какое влияние эти белки оказали на способность вируса проникать в ядро и интегрироваться в геном хозяина.
Они обнаружили, что вирусный капсид играет важную роль в способности вируса проникать в ядро и перемещаться по нему.
Многие исследования выдвинули гипотезу о том, что ВИЧ выделяет белковый капсид до того, как попадет в комплекс ядерных пор. Изображения Брасса ясно показывают, что часть капсида все еще присутствует и связана с вирусной ДНК после проникновения в ядро, причем окончательное выделение капсида происходит, когда вирус достигает своего конечного пункта назначения. Дальнейшие исследования показали, что именно использование капсидом белков-хозяев CPSF6 и TNPO3 позволяет ему проникать в ядро и перемещаться по нему. Без этой помощи вирус оказывается за пределами ядра или на его границе.
Белок CPSF6 обычно работает для модификации вновь созданных матричных РНК клетки, и его цель — найти активные гены, как только он попадает в ядро. Исследование Брасса показывает, что когда клетка инфицирована ВИЧ, вирус использует CPSF6, запуская белок, который переносится через ядерную мембрану ядерным импортером TNPO3. Попав внутрь ядра, ВИЧ — поскольку он связан с CPSF6 — переносится в активные области гена, где он предпочитает интегрироваться.
В отсутствие TNPO3 вирус не может проникать через ядерную мембрану. А без CPSF6 он не может найти активные области гена, которые он предпочитает для интеграции.
Вместо этого он интегрируется в менее активные регионы.
Эти результаты указывают на ранее не описанное состояние жизненного цикла ВИЧ, которое происходит между моментом проникновения вируса в ядро и моментом, когда его ДНК интегрируется в наш геном, что было обнаружено только благодаря разработке ViewHIV.
«Мы считаем, что ViewHIV станет отличным инструментом для раскрытия механизмов, которые управляют ранним этапом жизненного цикла ВИЧ», — сказал Брасс. «С помощью нашей методики мы можем лучше определить, как ВИЧ внедряется в нашу ДНК, и разработать новые способы, чтобы этого не произошло."