Команда SHERLOCK разработала простую бумажную полоску для отображения результатов теста на единственную генетическую подпись, заимствовав из визуальных подсказок, распространенных в тестах на беременность. После погружения бумажной полоски в обработанный образец появляется линия, указывающая, была ли обнаружена целевая молекула или нет.Эта новая функция помогает подготовить почву для использования в полевых условиях, например, во время эпидемии. Команда также увеличила чувствительность SHERLOCK и добавила способность точно определять количество мишени в образце и тестировать сразу несколько мишеней.
Все вместе эти достижения ускоряют способность SHERLOCK быстро и точно обнаруживать генетические сигнатуры, включая патогены и ДНК опухолей, в образцах.Описанные сегодня в Science, инновации основаны на более ранней версии SHERLOCK (сокращение от Specific High Sensitivity Reporter unLOCKing) и дополняют растущую область исследований, в которых системы CRISPR используются не только для редактирования генов. Работа, проводимая исследователями из Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда и Массачусетского технологического института, может оказать преобразующее воздействие на исследования и глобальное общественное здравоохранение.«SHERLOCK предоставляет недорогой, простой в использовании и чувствительный метод диагностики для обнаружения материала нуклеиновых кислот — а это может означать вирус, ДНК опухоли и многие другие мишени», — сказал старший автор Фэн Чжан, член основного института Broad Institute, исследователь в Институте исследований мозга Макговерна при Массачусетском технологическом институте и профессор нейробиологии Джеймса и Патрисии Пойтрас. «Усовершенствования SHERLOCK теперь дают нам еще больше диагностической информации и приближают нас к инструменту, который можно использовать в реальных приложениях».
Ранее исследователи продемонстрировали полезность SHERLOCK для целого ряда приложений. В новом исследовании команда использует SHERLOCK для обнаружения внеклеточной опухолевой ДНК в образцах крови пациентов с раком легких и для одновременного обнаружения синтетических вирусов Зика и Денге в дополнение к другим демонстрациям.Четкие результаты на бумажной полоске«Новое бумажное считывание SHERLOCK позволяет вам увидеть, присутствовала ли ваша цель в образце, без инструментов», — сказал соавтор исследования Джонатан Гутенберг, аспирант Гарварда в лаборатории Чжана, а также лаборатории члена института Broad core Авива Регева. . «Это приближает нас к диагностике, готовой к работе в полевых условиях».
Команда предполагает широкий спектр использования SHERLOCK благодаря его универсальности в обнаружении мишеней нуклеиновых кислот. «Эта технология демонстрирует потенциал для многих приложений здравоохранения, включая диагностику инфекций у пациентов и обнаружение мутаций, которые придают лекарственную устойчивость или вызывают рак, но ее также можно использовать для промышленных и сельскохозяйственных приложений, где этапы мониторинга в цепочке поставок могут сократить количество отходов и повысить безопасность. ", — добавил Чжан.ОсновыВ основе успеха SHERLOCK лежит связанный с CRISPR белок Cas13, который можно запрограммировать на связывание с определенным фрагментом РНК.
Мишень Cas13 может быть любой генетической последовательностью, включая вирусные геномы, гены, придающие бактериям устойчивость к антибиотикам, или мутации, вызывающие рак. При определенных обстоятельствах, как только Cas13 обнаруживает и разрезает свою указанную цель, фермент переходит в режим перегрузки, без разбора разрезая другие РНК поблизости. Чтобы создать SHERLOCK, команда использовала эту «нецелевую» деятельность и использовала ее в своих интересах, разработав систему, совместимую как с ДНК, так и с РНК.Диагностический потенциал SHERLOCK основан на дополнительных цепях синтетической РНК, которые используются для создания сигнала после расщепления.
Cas13 будет расщеплять эту РНК после того, как она поразит свою исходную цель, высвобождая сигнальную молекулу, что приводит к считыванию, которое указывает на присутствие или отсутствие цели.Обнаружение нескольких целейПлатформа SHERLOCK теперь может быть адаптирована для тестирования нескольких целей. Первоначально SHERLOCK мог обнаруживать только одну последовательность нуклеиновой кислоты за раз, но теперь один анализ может давать флуоресцентные сигналы для четырех различных мишеней одновременно — это означает, что для прохождения диагностических панелей требуется меньше образца.
Например, новая версия SHERLOCK может определить за одну реакцию, содержит ли образец частицы вируса Зика или денге, которые вызывают схожие симптомы у пациентов. Платформа использует ферменты Cas13 и Cas12a (ранее известные как Cpf1) из разных видов бактерий для генерации дополнительных сигналов.Повышенная чувствительностьВо второй итерации SHERLOCK также используется дополнительный фермент, связанный с CRISPR, для усиления сигнала обнаружения, что делает инструмент более чувствительным, чем его предшественник. «С помощью оригинального SHERLOCK мы обнаруживали одну молекулу в микролитре, но теперь мы можем достичь 100-кратной чувствительности», — объяснил соавтор исследования Омар Абудайе, аспирант Массачусетского технологического института в лаборатории Чжана в Брод. «Это особенно важно для таких приложений, как обнаружение внеклеточной опухолевой ДНК в образцах крови, где концентрация вашей мишени может быть чрезвычайно низкой.
Это новое поколение функций помогает сделать SHERLOCK более точной системой».Авторы сделали свои реагенты доступными для академического сообщества через Addgene, а их программные инструменты доступны через веб-сайт лаборатории Zhang и GitHub.
Это исследование было частично поддержано NIH (гранты 1R01-HG009761, 1R01-MH110049, 1DP1-HL141201, F30 NRSA 1F30-CA210382); Агентство по уменьшению оборонной угрозы (грант HDTRA1-14-1-0006).