Таканари Иноуэ, доктор философии.D., доцент кафедры клеточной биологии медицинского факультета Университета Джона Хопкинса сравнивает клетку и ее отсеки с домом с множеством комнат. «Мы подозревали, что АМПК в одних помещениях работал больше, чем в других. Ставим шпионов в каждую комнату, чтобы следить за ее активностью.
Затем мы разработали группу саботажников, которые отключили активность AMPK в одной комнате за раз, чтобы мы могли видеть воздействие на ячейку », — говорит он.
Резюме исследования будет опубликовано в журнале Cell Reports 16 апреля.
AMPK — это почти повсеместный фермент, который поддерживает энергетические ресурсы клеток.
Основной энергетической валютой в клетках является молекула под названием аденозинтрифосфат (АТФ), к которой, как следует из названия, прикреплены три фосфатные группы. Энергия высвобождается из АТФ, когда одна или две фосфатные группы удаляются, оставляя аденозиндифосфат (АДФ) или аденозинмонофосфат (АМФ), соответственно. Если какая-либо из этих молекул связывается с AMPK, форма фермента изменяется, показывая его сайт активации, позволяя другим ферментам активировать его, добавляя фосфатную группу к сайту.
После активации AMPK добавит свою фосфатную группу к другим белкам, что в конечном итоге вызовет различные изменения в клетке, такие как помощь в ее росте в размерах, разрушение изношенных частей клетки, развитие направленности или включение генов.«Было неизвестно, как один белок может давать такие разные результаты, но одна из гипотез заключалась в том, что уровни его активности были разными в разных отделах клетки, что позволяло ему влиять на разные наборы других белков.
Чтобы понять, к чему это привело, команда Иноуэ разработала серию специальных молекул, чтобы «шпионить» за AMPK в определенных отсеках внутри выращенных в лаборатории клеток различных видов. Как только шпионы коснулись AMPK, они испустили свет, который можно было увидеть и измерить. В нестрессированных клетках команда обнаружила различные уровни активности AMPK в разных клеточных компартментах.
Ядро, цитоплазма и клеточная мембрана имели наименьшую активность, в то время как аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум имели наибольшую активность.
Когда исследователи удерживали глюкозу из клеток, чтобы снизить их энергетический уровень и повысить активность AMPK, они увидели, что каждый отсек реагировал в разной степени и в уникальные временные рамки. Наибольшее изменение активности было в цитоплазме, где активность AMPK увеличилась более чем на 40 процентов всего через полчаса после отмены глюкозы, которая поддерживалась в течение четырех часов. В митохондриях, с другой стороны, наблюдалось более скромное увеличение, которое не появлялось, пока не прошло четыре часа.
Наконец, команда модифицировала шпионов, чтобы они могли контролировать свое местоположение в режиме реального времени. Эти шпионы сначала рассредоточены по ячейке, но затем быстро собираются в определенном отсеке в ответ на «химическую команду», применяемую к ячейкам. (см. ВИДЕО) Некоторые из этих молекул были простыми шпионами, как и другие, которые сообщали о деятельности AMPK, но другие были «саботажниками», потому что они могли подавить AMPK и отвлечь его от работы над тем, что он должен.
«Мы смогли остановить активность AMPK в определенных отсеках — и нигде больше в ячейке — по запросу», — говорит Иноуэ. "И это происходит так быстро, в считанные секунды, что это не дает другим сигнальным системам клетки времени адаптироваться, поэтому наши наблюдения полностью связаны с отсутствием активности AMPK."
Он говорит, что серию молекулярных инструментов можно использовать для дальнейшего раскрытия тайны активности AMPK и многих других ферментов.