Зонд, разработанный группой ученых из Вандербильта, представляет собой генетически модифицированную форму люциферазы, фермента, который ряд других видов, включая светлячков, используют для получения света. Об этом говорится в статье, опубликованной в журнале Nature Communications 27 октября.Ученые создали эту технику как новый и улучшенный метод отслеживания взаимодействий в больших нейронных сетях мозга.«В течение долгого времени нейробиологи полагались на электрические методы для регистрации активности нейронов.
Они очень хороши для мониторинга отдельных нейронов, но ограничены небольшим количеством нейронов. Новая волна заключается в использовании оптических методов для регистрации активности сотен нейронов. в то же время ", — сказал Карл Джонсон, профессор биологических наук Стивенсона, возглавлявший эту работу.«Большинство усилий в оптической записи используют флуоресценцию, но для этого требуется сильный внешний источник света, который может вызвать нагрев ткани и может мешать некоторым биологическим процессам, особенно тем, которые являются светочувствительными», — сказал он.Основываясь на своих исследованиях биолюминесценции «грязного маленького организма, зеленой водоросли Chlamydomonas, которая никого не волнует», Джонсон и его коллеги поняли, что если бы они могли совместить люминесценцию с оптогенетикой — новой биологической техникой, которая использует свет для управления клетками, особенно нейроны в живой ткани — они могут создать новый мощный инструмент для изучения активности мозга.
«Существует внутренний конфликт между флуоресцентными методами и оптогенетикой. Свет, необходимый для создания флуоресценции, мешает свету, необходимому для управления клетками», — сказал Джонсон. «А люминесценция работает в темноте!»Джонсон и его сотрудники — доцент Донна Уэбб, доцент Шуцун Ши, аспирант Цзе Ян и докторант Деррик Камбербэтч в области биологических наук, а также профессор Дэнни Уиндер и аспирант Сэмюэл Сентанни в области молекулярной физиологии и биофизики — генетически модифицировали тип люциферазы, полученный из люминесцентных видов креветок, чтобы они загорались при воздействии ионов кальция.
Затем они захватили вирус, поражающий нейроны, и прикрепили его к своей сенсорной молекуле, так что сенсоры были вставлены внутрь клетки.Исследователи выбрали ионы кальция, потому что они участвуют в активации нейронов.
Хотя уровни кальция высоки в окружающей области, обычно они очень низкие внутри нейронов. Однако внутренний уровень кальция кратковременно повышается, когда нейрон получает импульс от одного из своих соседей.Они протестировали свой новый датчик кальция с помощью одного из оптогенетических зондов (каналродопсин), который заставляет каналы ионов кальция во внешней мембране нейрона открываться, наполняя клетку кальцием.
Используя нейроны, выращенные в культуре, они обнаружили, что люминесцентный фермент заметно реагировал на приток кальция, производимый при стимуляции зонда короткими вспышками видимого света.Чтобы определить, насколько хорошо их датчик работает с большим количеством нейронов, они вставили его в срезы мозга из гиппокампа мыши, содержащие тысячи нейронов.
В этом случае они залили срезы повышенной концентрацией ионов калия, что привело к открытию ионных каналов клетки. Опять же, они обнаружили, что датчик реагировал на изменения концентрации кальция повышением яркости и затемнением.«Мы показали, что этот подход работает», — сказал Джонсон. «Теперь мы должны определить, насколько он чувствителен.
У нас есть некоторые признаки того, что он достаточно чувствителен, чтобы обнаруживать срабатывание отдельных нейронов, но мы должны провести больше тестов, чтобы определить, действительно ли он обладает такой способностью».Работа финансировалась грантами Национального института здравоохранения R21 DA034446, R21 MH107713, R01 GM092914, грантом Национального научного фонда DBI-1450897 и грантом Института мозга Вандербильта.