Многие аспекты обучения и поведения сопровождаются структурными изменениями нейронов в синапсе — месте, где нейроны общаются друг с другом, отправляя и получая нейротрансмиттеры, такие как дофамин, серотонин и глутамат. Возможность увидеть такие структурные изменения в трехмерном изображении поможет нам понять, как выглядят нормальные изменения, и позволит нам идентифицировать различия, возникающие в ненормальных ситуациях.
Для этого очень полезны флуоресцентные микроскопы, потому что флуоресцентные белки часто используются для отслеживания нейронов, происходящих из определенной области мозга, или для маркировки конкретных представляющих интерес структур, таких как синапсы нейрона. Одна из важных проблем заключается в том, что для создания точных трехмерных изображений глубоких тканей мозга мозг должен быть прозрачным.
В последние годы было разработано несколько методов прозрачности тканей, этот процесс называется оптической очисткой. Две проблемы, которые мешают разработке этих агентов для микроскопии высокого разрешения, — это повреждение тканей и сферические аберрации, которые создают неточные изображения. На сегодняшний день методы очистки были полезны для визуализации крупных структур с низким разрешением, но повреждение тканей агрессивными химическими веществами или отек делают их непрактичными для визуализации тонких структур на нейронах, таких как дендритные шипы или аксональные бутоны.
Опираясь на свой предыдущий успех с очищающим агентом SeeDB (See Deep Brain), группа CDB во главе с Такеши Имаи разработала новый рецепт, названный SeeDB2, который дополнительно минимизирует разрушительные сферические аберрации, поддерживает мелкие структуры без повреждений и позволяет ярким и светлым. стабильные флуорофоры — химические соединения, которые при возбуждении переизлучают свет и позволяют получать флуоресцентные изображения.
Такие вещества, как вода и масло, замедляют свет и изгибают его в разной степени, что количественно определяется их показателями преломления. Чтобы очистить ткань, не вызывая рассеяния света и сферических аберраций, команда разработала стратегию, позволяющую сопоставить показатель преломления очищающего агента с показателями образцов ткани. Специальный рецепт йогексола и сапонина, забуференного Трис-ЭДТА, соответствовал показателю преломления образцов, используемых для получения изображений с высоким разрешением с помощью линз объектива с масляной иммерсией, и доказал свою эффективность очистки и сохранения образцов без каких-либо морфологических повреждений.
«Хотя степень прозрачности, полученная с помощью SeeDB2, ниже, чем та, которая может быть достигнута с помощью других агентов оптической очистки», — отмечает Имаи, — «только SeeDB2 можно использовать для получения изображений тонких нейронных структур со сверхвысоким разрешением.
Поэтому исследователи должны выбрать очищающий агент, который лучше всего соответствует их экспериментальным целям."
Используя SeeDB2, команда смогла получить изображения нейронных цепей сверхвысокого разрешения в 10 раз глубже в мозгу, чем это было возможно в прошлом, и показала, что их подход совместим с несколькими различными типами микроскопии сверхвысокого разрешения.
Поскольку многие когнитивные расстройства связаны с синаптическими аномалиями, в качестве способа продемонстрировать, чего можно достичь с помощью их нового рецепта, группа сосредоточилась на визуализации дендритов нормальных нейронов и тех, в которых была важна субъединица возбуждающего глутаматного рецептора. выбитый. Они смогли увидеть, что размер шипов был больше, и что тормозные синапсы накапливались в увеличенных шипах мутантных нейронов.
Имаи отмечает: «Обнаружение того, что изменения в возбуждающем рецепторе влияют на тонкие структуры тормозных синапсов, является важным открытием, которое стало возможным благодаря нашей новой формуле оптического просветления. Мы ожидаем, что визуализация нейронных цепей глубоких тканей со сверхвысоким разрешением останется мощной стратегией для изучения коннектомики на синаптическом уровне, и что SeeDB2 будет играть важную роль в том, чтобы сделать эти исследования возможными."